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詳細信息

【細胞平臺】TUNNEL檢測細胞凋亡

 實驗原理

對不同組織切片先增加細胞膜通透性,然后讓 rTDT 和生物標記的 dTUTP 進入細胞內,在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3』-OH 結合,再用 HRP 標記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結合(每個鏈霉親和素至少可以再結合 3 個 biotin 分子),最后用 DAB、過氧化氫與 SP 上的辣根過氧化物酶 HRP 發生氧化、環化反應,形成苯乙肼聚合物而呈現棕褐色,最終通過計數每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發生情況。

關鍵步驟

1. 充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯兩次 5-10 min;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,這些以便后面的結合反應充分、均勻;

 

2. 把握好細胞通透的時間。一般根據切片的厚薄,選擇蛋白酶 k 的孵育時間,常用 10-30 min,幾 μm 切片用短時間;幾十 μm 切片用長時間,通過摸索達到既不脫片,有能夠使后面的酶和抗體進入胞內。

 

3. 適當延長 TUNEL 反應液的時間。一般是 37ºC 1 h,你也可以根據你的凋亡損傷程度,選擇更長的時間,可長至 2 h,但要結合你最終的背景著色。

 

4.DAB 顯色條件的選擇。一般 DAB 反應 10 min 左右,結合鏡下控制背景顏色,最長不超過 30 min;promega 公司提供的 DAB 液(桃紅色),不利于辨認棕褐色,我不太喜歡。

 

5.PBS 的充分清洗。 

 

6.  內源性 POD 的封閉 。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織,可適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度,可以達到很好的封閉效果,且不影響最終的特異性染色。

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