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elisa競爭法方法學開發

      一般來講,競爭法實驗主要涉及到三個物質,受體,配體和阻斷配體受體結合的樣品,如PD1受體,PD-L1配體,阻斷劑keyturda抗體,也常采用抗原,生物素化抗體,和阻斷抗原,生物素化抗體的樣品抗體組合。在競爭法開發的初期是建立起受體,配體相互作用的Test system。Test system的條件直接決定了競爭法實驗的準確度和測量范圍。具體到elisa競爭法方法開發上,主要包含兩個方面:

 
    1.設置多個陰性陽性對照組,確認實驗信號值是真實代表目標分子配體受體偶聯物。主要考察的是在間接的檢測過程中elisa反應過程采用的酶標板材,酶聯抗體和顯色液等試劑耗材是否干擾Test system。如下圖所示,嚴格來講在新建一個elisa方法時,需要建立一個陽性反應組。推薦閱讀:生物學功能評價和檢測分析方法的雙重間接性
 
elisa
 
    2.包被受體相對于反應配體的劑量曲線。在確認Test system中陽性信號能夠代表目標檢測分子后,包被少量的受體,2倍梯度稀釋反應配體12-16個點進行全曲線擬合,選取EC80或者EC50的配體濃度作為競爭法反應濃度。如下圖所示100ng/ml 受體100ul包被,受體從100000ng/ml 2倍梯度稀釋到0.2ng/ml,采用不同稀釋濃度的酶聯抗體進行檢測,整個劑量曲線有明顯的上,下平臺期,不同的酶聯濃度對信號的線性傳遞未造成明顯的影響,酶聯抗體起到了等比例將信號放大的作用,EC50為12ng/ml,EC80為40ng/ml??蛇x取100ng/ml 受體100ul包被,配體的競爭濃度選EC80為40ng/ml,酶聯稀釋度選擇1:600以獲得較大的信噪比窗口,增加方法測量范圍。在競爭法實驗中EC80代表了配體在Test system中占據了受體80%的結合位點,配體和受體在此相對狀態下,樣品對配體和受體的反應的阻斷比較敏感。受體過多,可提供的結合位點較多,樣品和受體結合不會影響到配體和受體的結合;配體過多,樣品加入后相對于配體較少,競爭不過配體,絕大多數配體依舊和受體結合,在兩種情況下樣品的加入都無法導致Test system發生明顯的變化(配體受體偶聯物減少),信號變化不明顯。
 
    建立好完整的Test system后,就是正式建立競爭法的劑量曲線了。主要包含兩個方面的內容:
 
    1.將選定EC80濃度的配體和梯度稀釋的樣品(2倍梯度稀釋12-16個點)混勻后加入包被好受體的酶標板材反應,得到有明顯上下漸近線的全曲線。
 
    2.根據實驗目的進行,選擇樣品合適的8個濃度梯度點進行實驗,簡化實驗操作流程,并初步評估方法的質量。具體到應用方面就是親和力大小比較和定量檢測方面。根據筆者的對比研究,發現elisa競爭法相同條件下的同一個曲線在濃度點細微調整下能夠滿足兩方面的需求,這是筆者開創性的發現,希望業界更多的同行能夠進行驗證。下文會具體進行兩方面應用方法的初步評估。v

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