<rt id="2k020"><small id="2k020"></small></rt>
<tr id="2k020"><optgroup id="2k020"></optgroup></tr>
<acronym id="2k020"><small id="2k020"></small></acronym>
歡迎光臨elisa試劑盒批發_elisa試劑盒廠家_酶聯免疫法價格_酶聯免疫法試劑盒-上海哈靈生物科技有限公司!
聯系方式
  • 公司名稱:上海哈靈生物科技有限公司
  • 公司地址:上海市楊浦區周家嘴路2001弄
  • 訂購熱線:021-61521620
  • 聯系電話:18217722762
  • 公司傳真:86-021-51010234
  • E-mail: 1828267695@qq.com
瀏覽歷史
當前位置: 當前位置: 首頁 > 文獻資料 > ELISA試劑盒實驗原理、步驟以及問題分析

詳細信息

ELISA試劑盒實驗原理、步驟以及問題分析

  “哈靈生物”產品文獻:ELISA試劑盒實驗原理、步驟以及問題分析

  ELISA試劑盒實驗原理

  酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)原理1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。

  ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。

  加入酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度類型及步驟

  ELISA的主要常用類型及步驟

  1. 間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(二抗)以檢測與固相抗原結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:

  1)將特異性抗原與固相載體聯結,形成固相抗原,洗滌除去未結合的抗原及雜質。

  2)加稀釋的樣本,保溫反應。樣本中的特異抗體與固相抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,樣本中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

  3)加酶標抗抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合,從而間接地標記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關。

  4)加底物顯色。

  2.競爭法測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點,因此不能用雙抗體夾心法進行測定,可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多,結合在固相上的酶標抗原愈少,最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

  如何選擇合適的陽性對照?陽性對照的基本組成應該盡量與檢測樣本的組成一致,一般陽性對照多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質,加入一定量的待檢物質。比如,以人血清為標本的測定,陽性對照多用確定的病人血清或者以復鈣人血漿為原料加入一定量標準品。

  如何選擇合適的陰性對照?陰性對照的基本組成也應該盡量與檢測樣本的組成一致,最好先行檢測確定其中不含待檢物質。比如,檢測人血清標本時,陰性對照應該選擇正常人血清;檢測免疫動物血清中抗體效價時,陰性對照應該選擇該動物的免疫前血清。如何選擇最優化的包被條件?

  1.包被抗原的選擇

  包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。天然蛋白需經純化才能用直接吸附法包被,對于含雜質較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應的物質如抗體直接吸附在酶標板上,再通過特異性反應使抗原固相化)。經純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物,由于分子量太小,往往難于直接吸附在酶標板上,一般都先使其與無關蛋白質如BSA等偶聯,偶聯物吸附于固相載體上。

  2.包被液的選擇

  一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液,如果包被的抗原在堿性條件下不穩定的話,也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

  3.包被溫度的選擇

  通常是4-8度條件下過一夜或者37度保溫2小時,我們強烈建議4-8度條件下包被,有利于蛋白活性的保持。

  4.包被濃度的選擇

  包被的最適濃度隨固相載體和包被物的性質變化,一般蛋白質的包被濃度為1-5ug/ml,要明確針對特定包被抗原的最適包被濃度需要通過實驗來確定。

  包板后需要封閉嗎?應該選擇什么樣的封閉體系?

  封閉是否必要,取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。一般說來,雙抗體夾心法,只要酶標記物是高活性的,操作時洗滌徹底,不經封閉也可得到滿意的結果。而在間接法測定中,封閉一般是必不可少的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉,AbMART推薦使用5%脫脂奶粉,價廉而且封閉能力強,不過5%脫脂奶粉只適合短期內使用,不宜長期保存,所以試劑盒中較少使用。

  如何正確使用酶結合物?

  1.酶結合物的稀釋液在稀釋液中常加入高濃度的無關蛋白質(例如1%BSA或5%脫脂奶粉),通過競爭抑制酶結合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑,如吐溫20(0.05%的濃度較為適宜)。

  2.正確稀釋酶結合物酶結合物的合適工作濃度需要通過預實驗來確定,濃度過高易導致本底偏高,濃度過低則會導致陽性信號的減弱。酶結合物最好在使用前稀釋,稀釋后的酶結合物不宜長期保存,因為低濃度的酶結合物極易失活。問題/可能的原因/解決方法

  1、問題:陰性對照產生了陽性的結果可能的原因:試劑或者耗材污染解決方法:更換試劑,使用一次性耗材

  2、問題:洗板出現問題解決方法:更換更強配方的洗滌液,增加洗板次數,延長洗板時間(如果是在雙抗體夾心法中出現,有可能是包被抗體與二抗間有交叉反應,則要更換包被抗體或二抗)

  3、問題:二抗產生了非特異性吸附解決方法:減少二抗使用量,縮短二抗反應時間

  4、問題:顯色液不新鮮解決方法:使用現配的顯色液

  5、問題:反應信號偏低可能的原因:包被條件不合適解決方法:提高包板濃度,延長包板時間

  6、問題:梯度稀釋做ELISA時產生跳孔現象可能的原因:酶標板疊放導致傳熱不均勻,各孔反應溫度有差異解決方法:盡量避免酶標板疊放在一起

  7、問題:移液器稀釋時未能保持連續性解決方法:定期校準移液器,確保移液器的正確使用

關注手機微站隨時隨地查看最新信息
  • elisa標準品質量保證
  • elisa質量有保證,放心產品
  • 中檢所承諾
  • 閃電發貨,承諾規定時間內發貨
  • 酶聯免疫法的正規發票
  • 公司可開具正規機打發票
友情鏈接:
elisa可信認證
新濠天地注册网站-新濠天地注册网站-官方信誉保证