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酶聯免疫檢測中:ELISA試劑盒操作要點

在進行酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)實驗中,有很 多需要注意的地方,由于ELISA方法廣泛應用在各種抗原和抗體的此定中。但是測定中的影響 因素很多,并且對操作有較高的要求,所以,在實驗中除了正常的相互反應,還會出現錯誤的 反應,導致錯誤的結果。 而造成這種錯誤的可能因素有:標本因素;試劑因素;操作因素等。 為此,本司針對常見問題做分析如下:

ELISA 試劑盒標準操作要點

無論在什么研究中,優質的試劑、良好的和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠 的必要條件。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應為新鮮的和高質量的純化 水電導率小于1.5μs/cm。

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A 標本的采取和保存

大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集,應注意避免溶血, 紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可 能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性 HRP,也會產生假陽性反應。一般說來,在5天內測定的血清標本可放置于4℃,標本在冰箱中 保存時間過長導致血清IgG聚合,使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。 凍結血清融解后,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻并避免產生氣泡?;鞚峄蛴谐恋淼? 血清標本應先離心或過濾,澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標 本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。 保存血清自采集時就應注意無菌操作,也可加入適當防腐劑。 抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性,建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑 。

B 加樣

加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出。推薦閱讀:生物學功能評價和檢測分析方法的雙重間接性

C 保溫

在建立ELISA方法作反應動力學研究時,實驗表明,兩次抗原抗體反應一般在37℃經1 -2小時,產物的生成可達頂峰。為避免蒸發,板上應加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板 孔,反應板不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力 求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成,采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育 中還有邊緣效應,邊上的值會偏高,建議為了客觀的判斷結果,將質控放在非邊緣位置。

D 洗滌

洗滌在ELISA試劑盒過程中雖不是一個反應步驟,但卻決定著實驗的成敗。ELSIA就是 靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相 抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯 等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。 可以說在ELISA操作中,洗滌是最主要的關鍵技術,應引起操作者的高度重視,操作者應嚴格 按要求洗滌,不得馬虎。 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的,非離 子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合,從 而削弱蛋白質與固相載體的結合,并借助于親水基團和水分子的結合作用,使蛋白質回復到水 溶液狀態,從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在 0.05%-0.2%之間,高于0.2%時,可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。 洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋,應按要求稀釋,所用的水電導率 最好在1.5us/cm之下,洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40秒左右,孔內 液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好,手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。

E 顯色和比色

TMB經HRP 作用后,約40分鐘顯色達頂峰,隨即逐漸減弱,至2 小時后即可完全消退至 無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這 類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各 類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標比色 儀簡稱酶標儀,通常指專用于測讀ELISA結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有:測 讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可 精確到0.001,準確性為±1%,重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下,操作時 室溫宜在15~30℃,使用前先預熱儀器15-30分鐘,測讀結果更穩定。 測讀A 值時,要選用產物的敏感吸收峰,如OPD 用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長 式測讀,即每孔先后測讀兩次,第一次在最適波長(W1),第二次在不敏感波長(W2),兩次 測定間不 移動ELISA 板的位置,最終測得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少 由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

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