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組織內質網內鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產品說明書

組織內質網內鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產品說明書 主要用途 組織內質網內鈣離子濃度熒光檢測試劑是一種旨在通過內質網鈣離子特異性熒光探針Mag-Fluo--AM,與鈣離子結合后,其熒光強度顯著增強,在熒光分光光度儀下觀察相對熒光峰值的變化,來測定內質網中總鈣離子濃度的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織(動物、人體等)內內質網鈣離子的濃度檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,檢測敏感。 技術背景 鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質,占1150克。其中99%的鈣以氟磷灰石鈣(calcium fluorophosphate apatite)形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式:一種是非彌散型蛋白結合鈣,其構成約40%至50%的血清中的總鈣含量;另一種為彌散型游離鈣,其進一步分成具有活性的復合鈣(complexed calcium)和離子鈣(ionized calcium)。鈣對神經肌肉興奮性(neuromuscular excitability)、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。在細胞內,鈣離子主要儲存在線粒體和內質網等細胞器中。其中內質網鈣離子儲存在控制細胞活化、調控信號通路、蛋白分子轉錄后修飾,維持細胞內環境鈣離子平衡方面起著重要作用。內質網鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法(flame photometry)、原子吸收分光光度法等技術,但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾,或者受限于儀器的特殊的要求,以及需要內質網純化。Mag-Fluo--AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標記染料,特異性地由內質網捕獲,可以檢測內質網內的游離鈣離子濃度的變化。在熒光分光光度儀下,激發波長490nm,散發波長525nm,來定量測定內質網的鈣濃度。 產品內容 清理液(Reagent A)   40毫升 染色液(Reagent B)  30微升 介導液(Reagent C)   600微升 通透液(Reagent D) 40微升 飽和液(Reagent E)   2毫升 陰性液(Reagent F)  2毫升 產品說明書 1份 保存方式 保存清理液(Reagent A)染色液(Reagent B)介導液(Reagent C)和飽和液(Reagent E)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里,有效保證6月 用戶自備 1.5毫升離心管:用于工作液配制的容器 細胞培養箱:用于染色孵育 96孔培養板:用于樣品操作的容器 熒光酶標儀:用于熒光分析 (共聚焦)熒光顯微鏡:用于熒光染色觀察 實驗步驟 一、測定準備 1.設定好熒光酶標儀(22℃):激發波長490nm,散發波長525nm 2.準備好純化的內質網樣品,置于冰槽里融化 3.測定開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent B)室溫下融化,然后分別移出 30 微升介導液(Reagent C)和 1.5 微升染色液(Reagent B)到新的1.5毫升離心管,標記為染色工作液,并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 二、熒光酶標儀檢測 1.準備1個黑色96孔板,標記為:內質網樣品孔、空白對照孔(不含內質網)、最大對照孔(不含內質網) 2.移取100微升純化內質網樣品(100微克)到內質網樣品孔里 3.加入100微升飽和液(ReagentE)到最大對照孔里 4.加入 100 微升陰性液(Reagent F)到空白對照孔里 5.分別加入 10 微升染色工作液到所有孔里 6.輕輕搖動黑色96孔板,混勻 7.室溫下(22℃),孵育30分鐘,避免光照 8.放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘,避免光照 9.即刻放進熒光酶標儀測讀:獲得相對熒光單位(relative fluorescence unit;RFU) 10.計算樣品內質網鈣離子濃度 11.【(樣品RFU-空白對照孔RFU)÷(最大對照孔RFU-樣品RFU)]×22(微摩爾;解離常數)=微摩爾/100微克內質網   三、(共聚焦)或熒光顯微鏡檢測 1.取出待測的5至10微米厚的冰凍切片(注意:使用快速冷凍處理-snap frozen的冰凍切片,不宜使用包埋處理) 2.小心加上 500 微升清理液(Reagent A),覆蓋切片樣品表面 3.小心移去切片樣品上的清理液(Reagent A) 4.移取 300 微升清理液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管 5.加入 30 微升染色工作液,混勻 6.小心加上上述染色工作液到切片樣品上,覆蓋切片樣品表面 7.室溫下孵育60分鐘,避免光照 8.小心移去染色工作液 9.小心加上200微升新鮮的清理液(Reagent A) 10.小心加上 2 微升新鮮的通透液(Reagent D) 11.放進37℃細胞培養箱里孵育4分鐘 12.小心移去通透液 13.小心加上500微升新鮮的清理液(Reagent A) 14.小心移去清理液 15.小心加上100微升新鮮的清理液(Reagent A) 16.蓋上蓋玻片 17.即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下進行觀察:激發波長490nm,散發波長525nm(內質網鈣離子呈現綠色) 注意事項 1.本產品為20次(顯微鏡)或60次(酶標板)操作 2.操作時,須戴手套 3.避免使用EDTA等處理樣品 4.孵育反應完成后即刻進行熒光測定 5.如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度 6.檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍 7.如果熒光淬滅敏感,建議使用抗淬滅劑1 8.可以使用熒光分光光度儀檢測 9.本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品 質量標準 1.本產品經鑒定性能穩定 2.本產品經鑒定檢測敏感

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